یکی از تست های تشخیصی مهم جهت تأئید وجود بتا تالاسمی مینور تعیین درصد هموگلوبین A2  می باشد .هموگلوبین A2را می توان به روش های زیر اندازه گیری نمود:
 - کروموتوگرافی تعویض یونی
   1-ستون میکرو
   2-HPLC (کروماتوگرافی تعویض یونی کاتیونیک)
- الکتروفورزاستات سلولز همراه با الوشن
اندازه گیری هموگلوبین A2  با استفاده از ستون میکرو
کروماتوگرافی تعویض یونی از انواع کروماتوگرافی های مایع – جامد بوده که بر اساس واکنش متقابل گروههای باردار مولکول هموگلوبین و رزین ، جداسازی صورت می گیرد. بر روی رزین یونهایی وجود دارد که قابل تعویض با یونهای همبار خود در همولیزات می باشند. در این روش از رزین آنیونیک دی اتیل امینواتیل سلولز DEAE52  استفاده می گردد. 

اساس روش :
1-    تورم رزین با بافر و به تعادل رسیدن آن با بافر تا PH رزین به PH بافر برسد
2-    اضافه نمودن همولیزات به ستون 
3-    جداسازی انتخابی اجرای نمونه بوسیله تغییر PH یا قدرت یونیک بافر 
در اندازه گیری هموگلوبین A2 به روش کروماتوگرافی ستونی با استفاده ازستون میکرومی توان از بافر گلایسین یا بافر تریس استفاده نمود. 

1)    روش گلایسین : بافر اول ترکیبی از گلایسین و سیانور پتاسیم (KCN) می باشد و بافر دوم همان ترکیب بافر اول به همراه کلرور سدیم می باشد که با اضافه نمودن نمک به بافر دوم قدرت یونی آن افزایش یافته و سایر هموگلوبین ها را از ستون خارج می سازد. PH رزین باید توسط HCL یک مولار و به کمک PH متر طوری تنظیم شود که پائین تر از نقطه ایزوالکتریک هموگلوبین A2 بوده و بالاتر از نقطه ایزوالکتریک سایر هموگلوبین ها باشد ، لذا بلافاصله پس از جذب همولیزات به روی رزین و اضافه نمودن بافر اول ، هموگلوبین A2 بصورت یک حلقه از ستون خارج می شود ، سپس با اضافه کردن بافر دوم ، با افزایش قدرت یونی ، سایر هموگلوبین ها نیز از ستون خارج می شوند. 

2)    روش تریس : روش پیشنهادی NCCLS می باشد. از محلول ذخیره تریس سه بافر با PH 5/8 ، 3/8 ، 7  به کمک HCL غلیظ تهیه می گردد. جداسازی در این روش بر اساس تغییر در PH  بافر صورت می گیرد. در این روش PH بافر دوم ( 3/8 ) بسیار مهم می باشد ( در این PH هموگلوبین A2 از ستون خارج می شود )
   این روش بدلیل استفاده از بافرهای متعدد ( 3 بافر ) در آزمایشگاهها کمتر مورد استفاده            قرار می گیرد. قابل ذکر است که درصد هموگلوبین A2 با استفاده از بافر تریس مختصری پائین تر از روش استفاده از بافرگلایسین میباشد.هم چنین در مقایسه با روش تریس ، بافر گلایسین حساسیت کمتری به تغییرات مختصر PH دارد. 

با تهیه رزین با بافر گلایسین و PH مناسب جهت جداسازی هموگلوبین A2 می توان نمونه هایی که حاوی هموگلوبین S میباشند را نیز جدا کرد. ( طول رزین داخل ستون باید افزایش یابد )
 بدلیل عدم ساخت رزین و بافر در آزمایشگاهها مراحل کنترل کیفی آن ذکر نمیگردد.

اکثرکیت های اندازه گیری هموگلوبین A2 موجود در ایران بر اساس کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از بافر گلایسین می باشد که جدا سازی هموگلوبین A2 بافر دوم به کمک  بافر اول یا همان محلول Developer صورت می گیرد.با تهیه لولـه تـوتال ( آب مقطر به همراه همولیزات ) بجای استفاده از بافر دوم درصد هموگلوبین A2 محاسبه می گردد. 

روش کار : با توجه به دستورالعمل درون کیت می باشد لذا از ذکر آن خودداری می گردد.
3)    *دستور العمل داخل کیت باید بدقت خوانده شود.

تهیه نمونه : خون به همراه ماده ضد انعقاد EDTA مناسب می باشد. حداکثر زمان نگهداری خون در دمای چهار درجه ( یخچال ) 8 روز می باشد . بهتر است همولیزات تازه و در روز آزمایش تهیه شود. 

 * نکات مهم در نقل و انتقال کیت هموگلوبین A2

1-    رعایت زنجیره سرد ( در مورد کیت هایی که باید حتما" در یخچال نگهداری شوند ) 
2-    بررسی صاف بودن ستونهای داخل کیت ( سر و ته نبودن ستونها ) 


*   رعایت نکات زیر در هنگام اندازه گیری هموگلوبین A2 توصیه می گردد: 

1- در صورتی که ژل داخل ستونها تغییر رنگ داده باشند نباید مورد استفاده قرار گیرند 
2- قبل از استفاده ازستونها و بافر باید حتما" به دمای اتاق برسند. (در مورد کیت هایی که در دمای یخچال نگه داری می شوند)
3- بهتر است ازپی پت پاستور تمیزو یا سمپلربا نوک نو جهت مخلوط نمودن رزین داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هوای داخل رزین استفاده نمود. 
4- ستونها بایدا زیک Flow rate  مناسب برخوردار باشند  ، 10-20  5- قبل از تهیه همولیزات باید نمونه خون تام کاملا" مخلوط شود .
6- پس از تهیه همولیزات بهتر است سریعتر کروماتوگرافی انجام شود ( پس از لیز کامل گلبول های قرمز ) 
7- قبل از نمونه گذاری به هیچ وجه نباید رزین خشک شود. به محض اینکه محلول روِیی رزین خارج شد باید همولیزات به ستون اضافه شود.
8-از سمپلر کالبیره باید جهت برداشت نمونه خون، بافرو همولیزات استفاده نمود.
9-باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع آوری هموگلوبین A2 از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ،ماژیک) مدرج نمائید.
10- افزودن همولیزات باید به آرامی و درست در سطح رزین صورت گیرد و سطح آن نباید در هنگام نمونه گذاری آسیب ببیند. 
11- بهتر است از یک نوک سمپلر جهت ریختن همولیزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود . 
12- به محض جذب شدن همولیزات برروی رزین باید بلافاصله بافر اضافه شود. 
13- اگر قبل از جذب کامل همولیزات برروی رزین، محلول بافر ریخته شود باعث کاهش کاذب هموگلوبین A2 می گردد. 
14- باید دقت شود تمامی بافر اضافه شده از ستون خارج شود.
15- قبل از خواندن جذب نوری ، باید لوله A2 و توتال کاملا" مخلوط شوند. 
16- باید از یک اسپکتروفتومتر کالیبره جهت خواندن جذب نوری لوله ها استفاده شود.
17- باید از یک نمونه که هموگلوبین A2 آن مشخص شده است(یا در صورت دسترسی به کنترل تجاری) به عنوان نمونه کنترل در هر سری  کاری استفاده گردد.
در صورتی که نمونه کنترل در محدوده مورد انتظار بخواند ، نیازی به انجام نمونه های بیماران بفرم دوتایی نمی باشد.

دامنه مرجع:

در کتب مرجع پیشنهاد میگردد که هر آزمایشگاه دامنه مرجع خود را با استفاده از حداقل 20 نمونه خون فرد سالم (هموگلوبین واندکس های گلبولی طبیعی ) بدست اورد و تفسیر نتایج هموگلوبین  A2در مقابل این دامنه صورت گیرد.قابل ذکر است که دامنه مرجع ممکن است مختصری در روش های مختلف اندازه گیری هموگلوبین  A2ودر بین آزمایشگاهها متفاوت باشد. (دامنه مرجع ممکن است در روش  HPLC 0.1-0.2% بالاتر باشد.)
بطور معمول دامنه مرجع هموگلوبین A2 برطبق توصیه NCCLS، 5/3-5/1%          می باشد در حالی که کتاب خون شناسی   Dacie3/3-2% را پیشنهاد میکند. در ایران نیز بنظر می رسد که دامنه پیشنهادی فوق قابل قبول تر باشد. 
در نهایت بدنبال تعین دامنه مرجع هم ،هنوز مشکلاتی در تفسیر نتایج لبه مرزی Border line وجود دارد.دراین موارد تکرار نتایج نیز ممکن است0.1-0.2% تفاوت نشان دهد.طبق پیشنهاد کتاب خون شناسیDacie بهتراست نتایج 3.4-3.7% هموگلوبین A2  بعنوان لبه مرزی در نظر گرفته شود و هموگلوبین A2  در همان نمونه ویک نمونه مجدد تازه تکرار شود.
* تفسیر نتایج هموگلوبین A2  باید در کنارشمارش گلبولهای قرمز، میزان هموگلوبین، اندکس های گلبولی وبررسی گسترش خون محیطی فرد صورت گیرد.در نهایت در موارد مشکوک و لبه مرزی باید بررسی فامیلی و آزمایش های تکمیلی نظیر جدا سازی زنجیره ها وبررسی DNA صورت گیرد.

دامنه مرجع%    تفسیر
7<    - وجود هموگلوبین  A2به تنهائی بسیار نادر است
- موارد نادر موتاسیونهای β تالاسمی
7-3.8    - صفت  β تالاسمی- هموگلوبین ناپایدار
- صفت هموگلوبین S- آنمی داسی شکل- آنمی مگالوبلاستیک
3.7-3.4    - فقر اهن بسیار شدیدهمراه با صفت  β تالاسمی
- همراهی واریانت های زنجیره دلتا( ς ) با صفت  β تالاسمی 
- تاثیر متقابل تالاسمیα و β
- موتاسیونهای نادر  β تالاسمی
- حضور هموگلوبین S  (در این مورد صحت اندازه گیری هموگلوبین A2مشکل می    شود ) 
-  تاثیر متقابل تالاسمیα و هموگلوبین S
- خطاهای آنالیتیکال(آزمایش باید تکرار شود)
3.3-2    - فرد طبیعی
- دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)
- موارد نادر صفت  β تالاسمی(شامل همراه شدن β با دلتا تالاسمی و α و β تالاسمی)
صفت αتالاسمی   
2>    - دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد) 
- صفت αتالاسمی  
- بیماری هموگلوبین H
- حضور واریانت های زنجیره دلتا
- این متد برای اندازه گیری هموگلوبین A2 اختصاصی نیست بطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین  A2نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین C,E,O arab و بعضی از واریانت های هموگلوبین A2 (A'2)و زنجیره دلتا میباشند. لذا هموگلوبین  A2از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست.
- در مواردی که هموگلوبین A2  بیشتر از 7% می باشد باید به وجود هموگلوبین های C,E,O arab شک نمودکه همراه با هموگلوبین  A2از ستون خارج می شوند.در این مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در PH=8.4و PH=6-6.2 و بررسی فامیلی می باشد.
- اگرتمامی همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پاِیین آید ،باید به وجود سایر هموگلوبینوپاتی ها نظیرهموگلوبین S یا  Dو G و یا هموگلوبین E,C شک نمود.
- اندازه گیری هموگلوبین  A2به روش کروماتوگرافی ستونی نباید در بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد.

در صورت وجود هموگلوبین A2 بیش از 7% در کروماتوگرافی ستونی مراحل زیر می بایست انجام گیرد:
1- انجام الکتروفورز استات سلولزدر  PH=8.4تایید وجود باند پر رنگ در ناحیه هموگلوبین  A2
2- انجام الکتروفورزسیترات اگار در PH=6-6.2      
      الف)در صورت مشاهده باند در منطقه هموگلوبین C بیمار هموگلوبین C دارد که مقدار بدست آمده برای هموگلوبین A2مجموع هموگلوبین  A2و  C است.
      ب)در صورتیکه باندی در منطقه هموگلوبین C دیده نشود  بیماراحتمالا هموگلوبین E یاO دارد که جهت تاییدوجود هموگلوبین E ، آزمایش رسوب با ایزوپروپانول انجام می گردد.
       ج) در صورت مشاهده باندی در منطقه هموگلوبین S   نمونه ممکن است  حاوی هموگلوبینSیا   Harlem –C  باشد،  که جهت تایید وجود هموگلوبین S تست حلالیت انجام می گردد. 
        د) اگر باندی در منطقه بین محل نمونه گذاری وباند هموگلوبین S دیده شود  نمونه حاوی هموگلوبین O arab خواهد بود.



  Anode(+)      

       ……..   C            
                                      
                                                  C-Harlem..........    S    
                ……….  O arab      
                                                         .......................Origin        

      D,E,G,Lepore,H,I,N,J     ............A   

    Barts................F  

       (  Cathode(-       


تصویر شماتیک جدا سازی هموگلوبین ها در الکتروفورز سیترات آگار



اندازه گیری هموگلوبین A2به روشHPLC

در این روش از ستون های تعویض کننده کاتیونی استفاده می گردد و دارای دقت و صحت قابل قبول می باشد.پس از جدب همولیزات در ستون ،با تغیر قدرت یونی بافرواریانت های هموگلوبین قابل جدا سازی می باشند.هموگلوبین ها براساس شارژ الکتریکی خود در زمان مشخصی Retention Time ازستون خارج می گردنند،که مبنای جدا سازی این متد می باشد.
مزایا:
- حجم کم نمونه( در حدود 5میکرو لیتر)
- زمان کوتاه اندازه گیری
- تعیین در صد هموگلوبین A2,Fوبسیاری از واریانت های هموگلوبین در هر سری کاری) هموگلوبین های S,C قابل جداسازی اند)

معایب :
-هموگلوبین Lepore ,Eبطور همزمان با هموگلوبین A2از ستون خارج می شوند.در این موارد باید از روش های تکمیلی تائید کننده استفاده گردد.
- هموگلوبین Dایران با هموگلوبین A2همزمان از ستون خارج می گردنند
-هزینه بالا

الکتروفورزاستات سلولز همراه با الوشن

بدنبال الکتروفورز استات سلولز وجداسازی باند ها،منطقه هر باند بریده شده و عمل الوشن در مجاورت آبمقطر صورت خواهد گرفت . با خواندن جذب نمونه در مقابل لوله شاهد در طول موج 415 نانومتر درصد هموگلوبین تعیین می گردد.
قابل ذکر است که این روش جهت تعیین درصد هموگلوبین A2 درحضور سایر هموگلوبین های همبار با هموگلوبین A2 از صحت مناسب برخوردار نمی باشد.



:: موضوعات مرتبط: ازمایش، هماتولوژی
:: برچسب‌ها: علوم ازمایشگاهی, ازمایش
ن :
ت : 2012/7/18
جهت اطلاع از تنظیمات و ویــــرایش این قالب اینجا را کلیک کنید.

.:: کلیک کنید ::.

قالب بلاگفا

قالب وبلاگ

purchase vpn

بازی اندروید